Gel de Poliacrilamida

Medicina

20/12/2012

Os géis de poliacrilamida foram muito utilizados para a análise de regiões polimórficas do DNA para a análise do perfil genético em identificação humana, no entanto, atualmente, os laboratórios utilizam a eletroforese capilar, como será posteriormente apresentado e estudado. Mas para haja melhor compreensão da eletroforese capilar, existe a necessidade de estudarmos a eletroforese em gel de poliacrilamida, pois foi primordial para a sua realização em equipamentos contendo capilares.

Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos fragmentos de DNA (5-500pb). O poder de resolução é extremamente alto, e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por pouco tão pouco quanto 1pb em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser separados uns dos outros (por exemplo, 1pb em 1000pb). Comparado com o gel de agarose, a separação dos fragmentos menores, como por exemplo, de 100 em 100 pares de bases, é maior, melhorando a análise do fragmento, principalmente se possuem variação de poucas bases. Outras vantagens em relação aos géis de agarose é que eles aceitam maiores quantidades de amostra sem que haja perda na resolução e o DNA recuperado dos géis de poliacrilamida são extremamente puros e podem ser utilizados para muitas finalidades. Géis de poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear do que géis de agarose (Sambrook et al, 2001).

Monômeros de acrilamida são polimerizados em longas cadeias em uma reação iniciada por radicais livres (Raymond et al, 1959). Na presença de N-N’-metilenobisacrilamida, essas cadeias formam ligações cruzadas. A porosidade do gel resultante é determinado pelo tamanho das cadeias e graus de ligações cruzadas que ocorrem durante a reação de polimerização. A porcentagem de monômeros de acrilamida utilizados na preparação do gel são determinadas pelo tamanho dos fragmentos de DNA a serem analisados (Chramback e Rodbard, 1971; Luney et al, 1971; Holmes et al, 1991; Sambrook et al, 2001).

A porcentagem da concentração total de acrilamida mais a bis-acrilamida é definida por T% e porcentagem de ligações cruzadas devidas à bis-acrilamida, por C%  (Stellwagen, 1997).

O aumento do valor de T, diminui o tamanho dos poros do gel de poliacrilamida. A relação do valor de C com o tamanho do poro é mais complexa. Geralmente o valor mínimo do tamanho do poro ocorre quando C é aproximadamente 5%, como ocorre em um gel com porcentagens de 19:1 de acrilamida e bis-acrilamida. Diminuindo o valor de C, há um aumento da estrutura do poro porque ocorre a diminuição de ligações cruzadas.

Há diferentes tipos de gel de poliacrilamida e cada um com suas indicações. Géis de poliacrilamida desnaturantes são utilizados para separação e purificação de fragmentos de DNA de fita única. São polimerizados na presença de um agente (formamida ou ureia) que suprime o pareamento de bases em ácidos nucléicos, saturando as pontes de hidrogênio. DNAs desnaturados migram através desses géis em uma razão que é praticamente independente da composição de bases e sequência. Entre os usos da poliacrilamida desnaturante estão o isolamento e análise de cada fita de DNA, análise de produtos de digestão por nuclease S1 e análise de produtos de reações de sequenciamento de DNA (Sambrook et al, 2001).

Géis de poliacrilamida não desnaturantes são utilizados na separação e purificação de fragmentos de DNA de dupla-fita, não sendo utilizados, atualmente, para a análise do perfil genético. Entretanto, a mobilidade eletroforética também é afetada pela composição de bases e seqüência, de modo que os dúplices de DNA de mesmo tamanho podem diferir na mobilidade em mais do que 10%. Os géis de poliacrilamida não desnaturantes são usados frequentemente para preparar fragmentos de DNA altamente purificados e para detecção de complexos de proteína-DNA (Sambrook et al, 2001).

São utilizados os mesmos tampões que descritos para o gel de agarose. A porcentagem de monômero de acrilamida a ser escolhida para utilização estará relacionada com a faixa de separação dos ácidos nucléicos a serem analisados.

O equipamento utilizado para a eletroforese em gel de poliacrilamida é composto por duas placas de vidro separadas por espaçadores de até 2mm, devidamente montadas em um sistema composto de uma caixa para tampão que entrará em contato com a parte inferior, e outra parte com a superior. A única conexão entre o tampão da caixa superior e inferior é o gel. Quanto mais alta a voltagem para a eletroforese, a menor espessura do gel e/ou maior porcentagem de poliacrilamida, há um aumento da resistência do gel, aumento demasiadamente a temperatura. Com isso, recomenda-se a utilização de placas com sistema de resfriamento ou aquecimento em eletroforese desnaturante em poliacrilamida, contendo uma placa de metal para dissipar o calor ou para seu aquecimento (Wartell et al, 1990; Sambrook et al, 2001).

Existem diferentes tipos de tampões de corrida, como aqueles que contêm Tris-acetato e EDTA (pH8,0; TAE), Tris-borato (TBE) ou Tris-fosfato (TPE) em concentrações de ~50mM (pH7.5-7.8). Segundo Sambrook et al (2001), TAE possui a menor capacidade tamponante e TBE e TPE são mais caros do que o TAE, mas possuem maior capacidade tamponante. Para fragmentos de baixo peso molecular, entretanto, a resolução é melhor nos tampões TBE ou TPE.


Os tampões de corrida ou “loading buffers” possuem 3 finalidades:
- aumentam a densidade das amostras, assegurando que a amostra afunde no pocinho;

- colorem as amostras facilitando sua visualização;

- contém corantes que movem para o ânodo em um campo elétrico em taxas previsíveis.

Azul de Bromofenol migra através do gel de agarose ~2.2 vezes mais rápido do que o Xileno Cianol e, corridos em tampão TBE 0,5X, corre aproximadamente na mesma velocidade de DNA de dupla-fita de 300pb em comprimento, enquanto o xileno cianol corre aproximadamente na mesma velocidade do DNA de dupla-fita de 4kb em extensão. Esta relação não muda muito para géis de agarose de porcentagem entre 0.5% a 1.4% (Sambrook et al, 2001).

A eletroforese capilar é amplamente utilizada em análise de DNA forense, por permitir que grandes quantidades de amostras sejam analisadas de maneira automatizada, além de necessitar de poucas quantidades de amostra pra o processo de injeção e podem ser facilmente reinjetadas se necessário. Separação eletroforética em capilar é realizada em menos de 1 hora, se comparado com as muitas horas necessárias para aquela realizada em géis de poliacrilamida para identificação humana. Além do tempo, a quantidade de passos para a elaboração do gel de acrilamida faz com que possa haver uma chance maior de erro durante a manipulação. A desvantagem é o custo inicial, para a compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que aqueles empregados na eletroforese em gel de poliacrilamida. No entanto, a eletroforese capilar é a mais empregada nos laboratórios de DNA forense (Butler, 2005).