Controle de qualidade externo: Testes de proficiência em genética forense

Medicina

20/12/2012

Atualmente, são realizados diversos testes de proficiência: o Serviço Cooperativo de Testes (Collaborative Testing Services), o Colégio Americano de Patologistas (College of American Pathologists), o Instituto de Pesquisas Sorológicas (Serological Research Institute), Grupo de Diagnóstico Cellmark (Cellmark Diagnostic´s Internacional Quality Assurance Survey) a Associação Americana de Bancos de Sangue (AABB), a Sociedade Americana de Diretores de Laboratórios Criminais (ASCLD/LAB), o Grupo Europeu de Perfil de DNA (EDNAP) e o Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de Genética Forense (GEP-ISFG) (PETERSON et al, 2003).

O primeiro teste de proficiência em análises clínicas relatado foi realizado em 1946 quando Belk e Sunderman distribuíram espécies anônimas para laboratórios de hospitais para avaliar a performance e padronizar os resultados. Os resultados variaram entre os laboratórios, avaliando-se a causa das discrepâncias dos resultados e a qualidade do trabalho realizado (BELK, SUNDERMAN, 1988).

Em 1974, a Fundação de Ciência Forense (Forensic Science Foundation) conduziu um estudo que trouxeram diversos problemas na análise e interpretação dos resultados. Uma combinação de grandes esforços dos laboratórios resultou no aperfeiçoamento na educação e nas oportunidades de treinamento, implementação de programas de certificação e creditação, bem como a realização de testes de proficiência e implementação de programas de controle de qualidade (PETERSON & MARKHAM, 1995 a e b).

A AABB publicou, em 1991, um conjunto de controle de qualidade em teste de DNA utilizando-se RFLP. O Grupo de Trabalho Técnico em Métodos Baseados em Análise de DNA (TWGDAM) foi criado nos Estados Unidos em 1988 e realizou sua primeira publicação de 1991 (PETERSON et al, 2003). Estabeleceu-se, nos EUA, um conjunto de padrões em controle de qualidade e testes de proficiência para aplicação em laboratórios forenses. Em 1994, criou-se o Conselho de DNA (DAB) cujos membros reportam-se diretamente ao diretor do FBI (ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA, 1994).

Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense (ISHF), que atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG), publica recomendações sobre análise de polimorfismos de DNA descrevendo e discutindo procedimentos para melhoria na reprodutibilidade e exatidão das metodologias utilizadas. O FBI recomenda outros detalhes sobre o controle de qualidade dos laboratórios que trabalham com evidências de DNA forense, que inclui além desses cuidados, a realização de testes periódicos de proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e para identificar tópicos que devem ser aperfeiçoados, e a auditoria para averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratório (DNA ADVISORY BOARD, 2000).

O Instituto Nacional de Padronização e Tecnologia (NIST) - desenvolve e certifica padrões físicos e químicos para comercialização, manufatura e utilização em pesquisas, incluindo os utilizados em análise de ácidos nucléicos. Entre eles, aqueles utilizados em diagnóstico molecular de doenças infecciosas, genéticas, câncer e, também, vínculo genético. O NIST também conduz um abrangente teste de validação interlaboratorial para análises forenses e identificação genética humana (BARKER, 2002).


A conduta de avaliação proposta para laboratórios que realizam vínculo genético normalmente são constituídos de amostras biológicas de indivíduos mãe, filho e suposto pai, com o intuito de comparar as estratégias utilizadas, seus protocolos metodológicos, assim como os resultados obtidos entre os participantes (BJERRE et al, 1997; HALLENGERG & MORLING; 2001).

A avaliação do DNA degradado por diversas condições foi realizada por diversos laboratórios europeus. Inicialmente, células foram degradadas em condições específicas (BENDER, 2004) e foram encaminhadas para 50 laboratórios europeus, com o objetivo de melhorar o entendimento sobre os diferentes parâmetros que influenciam a tipagem pelas STRs de DNA degradado. Abrange ainda a tentativa de otimização para minimizar problemas. Após a análise dos resultados de 38 laboratórios participantes concluíram que para superar os efeitos da degradação do DNA, protocolos da PCR devem ser otimizados para todos os parâmetros. Protocolos flexíveis para a interpretação dos perfis alélicos devem ser desenvolvidos, e se necessário, a elaboração de softwares para auxiliar na análise (SCHNEIDER et al, 2004).

Em 2004, O NIST (KLINE et al, 2005) realizou estudo de quantificação de DNA entre 80 laboratórios que participaram do 14° Simpósio Internacional de Identificação Humana que foi realizado em Phoenix, AZ, EUA. Oito amostras de DNA extraídas foram liofilizadas e entregues aos laboratórios objetivando: examinar os resultados avaliando a performance dos laboratórios quando se utiliza concentrações baixas de DNA, fato frequente em casos forenses, e examinar a consistência das diversas metodologias utilizadas entre os laboratórios.

Ao final do estudo, houve uma variabilidade de 20% nos resultados utilizando-se 19 metodologias. Desses, 65% derivaram de técnicas abrangendo hibridização Slot Blot e 21%, da PCR em tempo real. Comparando-se os resultados de todos os laboratórios teve-se uma variação de 20% utilizando-se técnicas diferentes. Com isso, estabeleceu-se que o controle positivo externo que foi gerado deveria ter os seus resultados comparados dentro de cada metodologia utilizada, quando o material fosse utilizado em testes de proficiência.

Um exercício colaborativo foi realizado em 1989 por 12 laboratórios Europeus utilizando-se VNTR pYNH24. Os resultados demonstraram que a correlação entre os perfis genéticos adquiridos podem ser alcançados tanto intra como entre os laboratórios, sob condições mínimas de padronização (SCHNEIDER et al, 1991).

Um dos primeiros estudos em controle de qualidade das STRs foi realizado entre laboratórios participantes de um encontro do TWGDAM em 1995. Empregou-se, inicialmente, um triplex que amplificava as STRs CSF1PO, TPOX, TH01 e posteriormente foi acrescentado vWA, tornando-se um quadruplex. Mesmo utilizando-se protocolos idênticos, inúmeros fatores contribuíram para a variabilidade de tamanho dos alelos identificados que chegaram a uma diferença de acima de 4bp. Entre todos os fatores discutidos, a instabilidade eletroforética dos equipamentos pode ser considerada como primordial (MICKA et al, 1999).


A análise das STRs não substituiu de imediato os VNTRs. Em 1995 e 1996, um grupo filiado à Sociedade Internacional de Genética Forense (BJERRE, 1997) observou que as VNTRs eram analisadas por RFLP e seus fragmentos identificados utilizando-se sistema de câmera de detecção (57%) e 14% ainda utilizavam réguas para mensuração.

Um estudo semelhante foi realizado em 1997,1998 e 1999 pelo mesmo grupo, no qual houve uma diminuição na análise de VNTR por de sondas de lócus e RFLP de 83% em 1997 a 66% em 1999, enquanto mais de 90% dos laboratórios já utilizavam sistemas baseados na PCR. O coeficiente de variação foi de 1,3% na análise de VNTRs e de menos de 0,3% na análise das STRs. Segundo os autores, esse baixo valor se deu pela incorporação de conjuntos comerciais para análise de STR, melhorando a qualidade da mesma (HALLENBERG & MORLING 2001).

No Brasil, os exercícios de controle de qualidade em identificação humana pelo DNA são realizados pelo GEP-ISFG e pela SLAGF, não havendo um grupo brasileiro específico que realize testes de proficiência. Desde 1992, o GEP-ISFG realiza um programa de controle de qualidade, sendo relatados como membros: 324 geneticistas forenses de 118 laboratórios de 19 países. Espanha, Portugal, Brasil, Argentina e Colômbia são os países mais representativos do grupo. A maioria dos laboratórios está relacionada com testes de paternidade, sendo 58% envolvidos com casos criminais (GOMÉZ et al, 2004).

As amostras incluídas nos testes de proficiência realizados pelo GEP-ISFG de 2002 a 2005 (GARCIA-HIRSCHFELD et al, 2005; GÓMEZ et al, 2004), variaram de cinco a seis amostras diversificando entre: 100µL de sangue, incluindo caso de teste de paternidade; um fio de cabelo de 2 cm, realizado desde 2000; e amostras forenses incluindo saliva, em 1997; amostras mistas, em 1998, 2000, 2003, 2004 e 2005; sêmen, em 2002 e não humanas em 2001. O número total de erros variou de 0,6% a 2,3% em diferentes anos, sendo que esse valor está concentrado principalmente em laboratórios que utilizaram sistemas manuais de eletroforese e marcadores alélicos construídos internamente.

A SLSGF observou que a porcentagem dos laboratórios participantes que estão obtendo resultados de análise corretos, vem crescendo progressivamente, variando de 48% em 1998 até 84% em 2004-2005 (PENACINO et al, 2005). Isso demonstra uma crescente melhoria da análise e de formação de recursos humanos mais adequados.

Também já foram realizados testes de proficiência para a análise de DNA mitocondrial (SCHNEIDER et al, 1999) e DNA do cromossomo Y (CARRACEDO et al, 1998; CARRACEDO et al, 2001), observando-se a importância e a crescente incorporação de programas de controle de qualidade e testes de proficiência em identificação humana pelo DNA pelos laboratórios.