Controle de Qualidade dos Laboratórios

Medicina

20/12/2012

O FBI acrescenta alguns itens para o controle de qualidade dos laboratórios que trabalham com evidências de DNA forense, que inclui além desses cuidados, a realização de periódicos testes de proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e para identificar tópicos que devem ser aperfeiçoados, e a auditoria para averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board, 2000).

O grupo espanhol e português da Sociedade Internacional de Genética Forense (Grupo Español Y Portugués - International Society for Forensic Genetics) objetivando a padronização das metodologias aplicadas e o controle de qualidade, realiza testes anuais de controle e de proficiência inclusive para laboratórios brasileiros credenciados. Esses testes consistem na análise de amostras de sangue e outro fluido biológico que simulam um caso forense para a manutenção da qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 2000).

No teste de vínculo genético familiar, a quantidade de amostra coletada normalmente é previsível e constante, não havendo muitos problemas com sua quantidade e qualidade. Entretanto, há materiais biológicos utilizados nestes testes que são coletados post-mortem oriundos de corpos exumados ou putrefeitos. Nesse caso, o material predominante está degradado da mesma maneira que as evidências de material biológico encontrado na cena do crime. O produto obtido de provas forenses é único e muitas vezes a garantia de sua qualidade só é adquirida através de alguma forma de controle independente e indireto (FBI, 2001, INTERPOL, 2001).

Controles de qualidade internos e externos servem para esse propósito. Os laboratórios forenses podem utilizar como controle interno, padrões reconhecidos e devidamente testados para tal finalidade. Controles externos devem ser introduzidos por programas administrados por organizações certificadas, que, inicialmente, preparam padrões de espécimes conhecidas, como sangue, e envia para todos os laboratórios credenciados. A metodologia utilizada e os respectivos resultados devem ser informados para o comitê, que analisará os dados e avaliará as alterações entre os laboratórios.

Controle de qualidade interno: ao analisar uma amostra biológica destinada à caracterização de vínculo genético, seja familiar ou em casos forenses, quaisquer contaminações com DNA estranho ou metodologias inadequadamente aplicadas podem resultar na impossibilidade de obter o DNA para amplificação, o não estabelecimento dos perfis genéticos e na inutilização da amostra. A primeira preocupação no estudo do perfil genético para a identificação humana é avaliar o quanto as metodologias de detecção utilizadas pelos laboratórios são válidas, assim como seus princípios. Para assegurar resultados, um programa de controle de qualidade é fundamental para os laboratórios que realizam identificação humana pelo DNA. Todas as metodologias de análise de DNA forense devem ser submetidas à validação para assegurar a reprodutibilidade e a robustez da técnica (KLOSTERMAN, 2001).

Procedimentos inadequados, que possam levar a contaminação de amostras pelos investigadores e os profissionais do laboratório, podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de normas e procedimentos de boas práticas de laboratórios são imprescindíveis, assim como, treinamentos específicos para o exame de DNA, tornaram-se obrigatórios (NEUMAYER, 1998; INTERPOL, 2001).

Desde 1992, a ISFH faz recomendações para a análise de DNA pela PCR. A contaminação pode ser evitada atendendo a certos cuidados durante todo o processo de análise de DNA. Eles vão desde a coleta e armazenamento do material biológico do qual será extraído o DNA até o próprio local de preparação da PCR (ISFG, 1992).

A preservação do DNA para a amplificação pela PCR também envolve o controle da temperatura, da umidade, o valor do pH (BENDER, 2004), a presença de ácido húmico e fúlvico e micro-organismos. A temperatura baixa pode preservar o DNA, seja ele datado de milhares de anos, ou de amostras forenses, assim como o DNA pode ser mais bem preservado em ambientes secos e com o mínimo crescimento de micro-organismos. A presença de ácido fúlvico e húmico inibiu a enzima Taq DNA polimerase. O pH neutro ou levemente alcalino na amostra também ajuda na preservação do DNA. Os micro-organismos se em grande quantidade podem degradar o DNA por completo (BURGER et al., 1999).

O FBI (1999, 2001) e a INTERPOL (2001) estabeleceram normas para os laboratórios forenses que participam da construção dos bancos de DNA internacional. Relacionam-se, principalmente, a procedimentos de coleta de amostras biológicas para análise do DNA que podem ser consideradas evidências, assim como, vários aspectos importantes para o treinamento técnico. No Brasil, a Secretaria de Segurança Pública do Estado de São Paulo (São Paulo, 1999) e a Secretaria Nacional de Segurança Pública – SENASP (2006) elaboraram documentos na tentativa de padronizar métodos e cuidados de coleta e manutenção das amostras pelos peritos criminais.

Sucintamente, a coleta do material deve ser realizada em condições assépticas e o indivíduo responsável pela coleta estar devidamente paramentado para se evitar contaminação em ambos os sentidos, como por exemplo, utilização de hastes com algodão, tubos, frascos e envelopes plásticos ou de papel. Para a coleta de amostras biológicas umedecidas é aconselhado a posterior secagem em ambiente estéril para o seu acondicionamento, no entanto, se isso não for possível, transporta-se imediatamente para o laboratório e congela-se a -20 °C no mínimo (SÃO PAULO, 1999; FBI, 1999 e 2001; INTERPOL, 2001; SENASP, 2006). Não se deve descongelar e congelar as amostras repetidamente, pois causaria a degradação do DNA (INTERPOL, 2001).

A escolha de métodos de extração de DNA está relacionada ao tipo de material e é importante para que se obtenha sucesso no estudo das STRs. Dessa maneira, cada laboratório deve realizar testes e otimizações de técnicas específicas para cada tipo de amostra forense (FBI, 2001; INTERPOL 2001; BUTLER, 2005; BONACCORSO, 2005). Em 1996, a maioria dos laboratórios entrevistados por uma filial da Sociedade Internacional de Genética Forense (53%) realiza a purificação do DNA pelo método orgânico (67%) seguido por não orgânico (33%).

Hoff-Olsen et al (1999) avaliaram cinco métodos de extração de DNA de tecidos humanos em estado de decomposição, que normalmente encontram-se altamente degradados, para análise das STRs. Os métodos empregados foram: extração orgânica com fenol-clorofórmio, sílica, filtro de fibra de vidro, Insta Gene Matrix™ e Chelex. O método da sílica, além de ser mais econômico, obteve melhores resultados ao comparar com método fenol-clorofórmio e resultou em um perfil genético completo em 90% dos casos contra 60%. Isso torna a sílica o método mais indicado pelos autores para a extração de DNA de amostras degradadas.

O método de Chelex não foi satisfatório para dentes, demonstrando que ele deve ser indicado principalmente para saliva, como descreveu Sweet et al (1996). Em casos como esse, emprega-se controle positivo constituído de amostra conhecida, para verificar se o método foi eficaz (FBI, 2001; INTERPOL, 2001).

Kwok & Higuchi (1989) e Neumaier (1998) descreveram várias recomendações para assegurar a qualidade dos métodos de biologia molecular em diagnósticos clínicos referentes às fases pré-analíticas e analíticas, principalmente para a realização da PCR. Objetivando evitar a contaminação das amostras, recomenda-se o isolamento físico da área de preparação da PCR, de seus reagentes e todos os materiais descartáveis utilizados na reação que devem ser previamente esterilizados.

Outros cuidados são fundamentais: os reagentes devem ser aliquotados; a utilização de luvas descartáveis é obrigatória e devem ser constantemente trocadas; deve-se ter cuidado ao abrir os tubos, pois parte do produto da PCR pode estar na sua tampa, possibilitando o seu desperdício; a mistura dos reagentes da PCR deve ser feita em um único tubo para posteriormente aliquotá-los em tubos individuais; deve-se adicionar o DNA individualmente em cada tubo e, finalmente, a inclusão obrigatória de controles negativos e positivos que auxiliam na detecção de contaminantes.

Atualmente utiliza-se a linhagem de célula comercial K562 como controle positivo (BJERRE et al, 1997; FBI, 2001; INTERPOL, 2001) ou uma amostra de DNA previamente validada pelo próprio laboratório ou externamente, como ocorre em kits de identificação humana (LAFOUNTAIN et al, 2001; KRENKE et al, 2002; LEVEDAKOU et al, 2002; SCHLENK et al, 2004).

Com o intuito de unificar os loci a serem utilizados em identificação humana para a incorporação de perfis genéticos de criminosos em seu banco de dados - CODIS, o FBI indicou a utilização de 13 loci para a sua análise; a saber, CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, e D21S11 (BUDOWLE & MORETTI, 1999).

Esse conjunto de loci tornou-se referência para todos os países no que se refere à ciência forense (SUN et al, 2003). Essa normatização permitiu estudos de frequências alélicas populacionais comparativas mais adequadas, possibilitando a universalização dos dados genéticos com critérios homogêneos. Com o objetivo futuro de implantar um banco de perfis genéticos de criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro já adotou as STRs sugeridas pelo CODIS como referência em seu Manual de Padronização de Exames de DNA em Perícias Criminais (SECRETARIA NACIONAL DE SEGURANÇA PÚBLICA - SENASP, 2005).


Esses loci contêm repetições bem caracterizadas que podem ser facilmente determinados com uso de uma referência de tamanho de fragmento de DNA. As vantagens da utilização de marcadores de tamanho em análise de DNA têm sido observadas desde o início das análises de VNTRs (WYMAN & WHITE, 1980).

A reprodutibilidade do método de detecção é confirmada observando a intensidade dos fragmentos do marcador podendo fornecer informações relativas à possível variação linha a linha na migração eletroforética de um mesmo material. O marcador é aplicado em linhas dispostas em regiões distintas, destinado a abranger uma maior região do gel. A separação eletroforética depende não somente do tamanho dos fragmentos, mas também da sequência do nucleotídeo (FRANK & KOSTER, 1979).

Dessa maneira, os marcadores de tamanho só garantem a eficácia da leitura do comprimento do DNA quando o marcador e o fragmento de DNA desconhecido têm a mesma sequência e o mesmo tamanho. Se as sequências do marcador e dos fragmentos das amostras não são os mesmos, a migração das amostras em relação os fragmentos do marcador podem ser diferentes. Isso se deve a parâmetros ambientais como porcentagem de agarose ou poliacrilamida, a quantidade de sais no tampão de corrida, a voltagem da eletroforese (BUDOWLE et al, 1995; MISCICKA-SLIWKA, 1997; SULLIVAN, 1992) ou mesmo a detecção da emissão de fluorescência presente no fragmento amplificado, como ocorre na utilização de iniciadores marcados com fluorescência (GRIFFITHS et al; 1998; WATSON et al, 2001).

Inúmeros marcadores de tamanho de fragmentos de DNA para eletroforese são disponibilizados comercialmente: 10, 50, 100 bp e 1Kb (INVITROGEN, 2007), ILS600 CXR presente no PowerPlex®16 (PROMEGA, 2007) e GS500 LIZ, no AmpFlSTRS® Identifilier™ (APPLIED BIOSYSTEMS, 2005); marcadores de peso molecular, como o Low DNA Mass Ladder (INVITROGEN, 2005-2); marcadores ou padrões alélicos que possuem os diversos alelos de um determinado lócus (PUERS et al, 1993; SULLIVAN et al, 1992).

O marcador alélico é uma mistura artificial de alelos presentes em uma população de uma determinada STR (SAJANTILLA et al, 1992, SULLIVAN et al, 1992). Esses marcadores alélicos servem como padrão de migração para cada STR. Eles devem ser ajustados para os diferentes tamanhos de mensuração presente em instrumentos e condições de cada laboratório (BUTLER, 2005).

Liu et al (1997) sugeriram a importância da análise do polimorfismo populacional que encontraram após o estudo da frequência alélica na população japonesa e chinesa e a construção do respectivo marcador alélico para a STR ACTBP2. Além de observarem alelos raros dentro de cada população, analisaram dois alelos que só foram encontrados na população japonesa, enquanto outros dois, somente na chinesa. Esse fato demonstra a variação dos polimorfismos em populações diferentes. Os autores encontraram também algumas micro variações alélicas raras. Todas essas variações foram incorporadas no marcador alélico construído pelos autores, possibilitando uma maior discriminação alélica.


Uma mistura de diversos marcadores alélicos foi desenvolvida para a sua utilização em sistemas multiplex, e possuíam as seguintes STRs: HUMTH01, D21S11, D18S51, D8S1179, HUMVWA, HUMFIBRA/FGA e amelogenina. Os produtos da PCR possuindo os alelos amplificados foram sequenciados e posteriormente agrupados para a sua análise em um sistema automático (GRIFFITHS et al; 1998; WATSON et al, 2001). Outro marcador alélico multiplex foi desenvolvido por Fuji et al (2000) para as STRs HUMTH01, D9S304 e D3S1744, e também homogeneizaram os produtos da PCR.

Outro fator que pode interferir na caracterização dos alelos é a quantidade de DNA utilizada na PCR podendo ser um fator crucial para sua amplificação correta. Kobayashi et al (2004) ao analisar os produtos de DNA obtidos pela PCR da STR TH01 de amostras de DNA de diferentes concentrações, constataram a perda de um alelo com quantidades de DNA muito baixas. De 100pg a 10ng, o DNA foi corretamente amplificado, mas quando analisou utilizou 10pg ou 1pg de DNA houve a perda de um dos alelos ou não foi possível detectá-los, sendo que o indivíduo era heterozigoto. Esse dado nos fornece justificativas para analisar cuidadosamente a quantidade de DNA a ser colocada para PCR, evitando a amplificação errônea dos fragmentos.