Cultivo de microrganismos com técnica quantitativa e de esgotamento

Farmácia

19/05/2013

Artigo produzido por:
Luana Fernanda Souza
Marinalva Assunção Ferreira
Thalita Carla de Carvalho Lima


INTRODUÇÃO
Os meios de cultura devem oferecer condições compatíveis à sobrevivência do microrganismo que se pretende cultivar. Os meios de cultura devem apresentar nutrientes, dos quais são indispensáveis seis elementos químicos: Carbono, Nitrogênio, Oxigênio, Hidrogênio, Enxofre e Fósforo, os quais podem apresentar-se em compostos orgânicos e inorgânicos, dependendo se a bactéria é heterotrófica ou autotrófica. Algumas bactérias fastidiosas têm necessidades nutricionais que exigem alguma outra substância no meio de cultura, como ferro, zinco, manganês, sódio, entre outros.

Além disso, os meios de cultura precisam de condições físicas para o crescimento das colônias, e, portanto devem ser incubados atentando-se a temperatura, atmosfera gasosa, pH, umidade, entre outras. Geralmente, as bactérias de interesse médico são as mesófilas e assim sendo, a temperatura de melhor crescimento deve ser em torno de 25 a 40ºC. No laboratório incuba-se a temperatura de 35ºC com oscilação em 1ºC, equiparando-se a temperatura do corpo humano.

Ágar nutriente é um meio simples que possui várias aplicações na microbiologia, deve-se apresentar de cor branca opalescente e pode possuir ou não crescimento de colônia na superfície do ágar.

O Ágar Sangue é um meio diferencial que oferece condições de crescimento para a maioria dos microrganismos e é usado principalmente para isolar agentes não fastidiosos, além disso, permite diferenciar vários tipos de microrganismos, tornando possível verificar se uma bactéria produz hemolisina ou não, sendo classificadas como:
- Beta hemólise: presença de halo claro ao redor da colônia que indica hemólise total dos eritrócitos;
- Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor da colônia que indica hemólise parcial dos eritrócitos;
- Gama hemólise: ausência de halo que indica preservação dos eritrócitos.

O Ágar Mac Conkey é um meio seletivo/diferencial que contém lactose, sais biliares e cristal violeta, em que esse inibe o crescimento de Gram positivos, sendo útil para isolar Gram negativos e, aquele diferencia as bactérias com capacidade fermentativa, através da alteração da cor para rosa devido à acidez.

Para a semeadura dos meios de cultura, pode utilizar dentre outras, as técnicas quantitativas e de esgotamento. A técnica quantitativa consiste em distribuir o material coletado por toda placa, estriando continuamente até o final da placa a fim de realizar a contagem das colônias. A técnica de esgotamento em placa consiste em depositar o material coletado sobre uma parte da placa e depois espalhá-lo com a alça de platina em campos diferentes de modo a obter quantidades progressivamente menores do material.

OBJETIVOS
Desenvolver a técnica quantitativa e a técnica de esgotamento, bem como realizar a contagem e análise macroscópicas das colônias.


MATERIAL E MÉTODOS
Técnica Quantitativa
- Swab
- Placa com meio Ágar nutriente
- Estufa
- Bico de bunsen
- Contador


Realizou-se o cultivo de duas amostras: primeiramente de mão suja, sem lavar e depois de mão limpa, devidamente lavada com água corrente e higienizada com álcool 70%. Inicialmente friccionou-se o swab na mão sem lavar e, atrás da chama, estriou-se o swab com a amostra coletada continuamente até o final da placa com ágar nutriente.

Posteriormente a mão foi lavada e logo se friccionou outro swab e, trabalhando atrás da chama, estriou-se o swab continuamente até o final de outra placa também com ágar nutriente. Ambas as placas foram identificadas conforme a situação da mão: sem lavagem e com lavagem. E foram incubadas na estufa temperatura de 35ºC com variação de 1ºC para mais ou para menos, durante 24 horas.

Depois deste período, analisaram-se as placas. No Contador, realizou-se a contagem das colônias de um dos cultivos, no qual foi realizada a contagem da placa contendo amostra da mão sem lavagem.
Técnica de Esgotamento
- Swab
- Placa com meio Ágar Sangue
- Placa com meio Ágar Mac Conkey
- Alça de platina
- Bico de bunsen
- Estufa
- Jarra de microaerofilia


Com o swab coletou-se amostra da mucosa bucal e trabalhando atrás da chama, depositou-se a amostra coletada no canto da placa do meio Ágar Sangue e com o mesmo swab repetiu o procedimento no meio de cultura Ágar Mac Conkey.

Posteriormente realizou-se a técnica de esgotamento, atrás da chama do bico de bunsen, nos dois meios de cultura em primeiro lugar no Ágar Sangue e em segundo lugar no Ágar Mac Conkey. De modo que se estriou, com auxilio da alça de platina, até o meio da placa a partir do canto onde amostra foi inicialmente depositada, em seguida girou-se a placa no sentido anti-horário e estriou-se até o meio da placa e o mesmo por mais duas vezes até estriar toda superfície do meio, conforme o esquema abaixo:

Para tanto, flambou-se a alça de platina e com ela estriou-se a superfície do meio Ágar Sangue usando a técnica de esgotamento e fizeram-se três perfurações no meio para verificar possível hemólise em profundidade. A seguir incubou-se a placa em jarra de microaerofilia em temperatura de 35ºC com variação de 1ºC para mais ou para menos, durante 24 horas.

Após, flambou-se a alça de platina e com ela estriou-se a superfície do meio Ágar Mac Conkey usando a técnica de esgotamento e incubou a placa na estufa em temperatura de 35ºC com variação de 1ºC para mais ou para menos, durante 24 horas.
Depois deste período, analisaram-se as placas e as características macroscópicas das células de uma das placas. Ao final, transferiu-se, com a alça em agulha, uma das colônias do meio Ágar Sangue para tubo com ágar nutriente e incubou a temperatura de 35ºC com variação de 1ºC para mais ou para menos, durante 24 horas, para futura analise e identificação.


RESULTADOS
Técnica Quantitativa
Na cultura sem lavagem das mãos observou-se o crescimento de colônias puntiformes pequenas, a maioria de coloração branca e algumas de coloração amarelada, totalizando 86 colônias ao final da contagem.

Na cultura com lavagem das mãos observou-se o crescimento de colônias em quantidade e coloração semelhantes a da placa anterior, com exceção das de coloração amarelada, porém não se realizou a contagem dessa placa.


Técnica de Esgotamento
No meio de cultura Ágar Sangue observou-se a formação gradual de colônias sobre a superfície da placa, sem a presença de halo. A colônia demonstrava características macroscópicas, tais como puntiforme média com borda regular, elevada e de consistência mucóide.

No meio de cultura Ágar Mac Conkey observou-se o crescimento de colônia em apenas uma região do meio e a colônia analisada tinha como características macroscópicas: tamanho puntiforme médio com borda irregular, elevada, coloração marrom translúcida e de consistência cremosa.



DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Técnica Quantitativa
As placas observadas demonstram que as mãos não foram suficientemente higienizadas, tendo em vista que ambas as placas ao final da incubação se apresentaram em proporções de colônias semelhantes, na placa das mãos lavadas não houve o crescimento de bactérias de aspecto amarelado, o que indica que essas bactérias foram removidas após a lavagem das mãos.

Técnica de esgotamento
As bactérias contidas no material coletado no meio Ágar Sangue demonstraram ser gama hemolítica, pelo fato de não terem apresentado halo envolto das colônias. Pode-se concluir que as bactérias que cresceram no Ágar Mac Conkey são Gram negativas e não fermentadoras, tendo em vista que nesse meio de cultura ocorre a supressão do crescimento de bactérias Gram positivas e a coloração em torno da colônia permanece inalterada devido a não ocorrência da fermentação da lactose.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Procedimentos laboratoriais: da Requisição do Exame à Análise Microbiológica. Módulo III. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia.asp. Acesso em: 29 de Ago. 2013.
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LAPORTA, M.Z; SILVA, P.R.S. Microbiologia: Atividades Práticas. 2006. Apostila do curso de Ciências Biológicas oferecida pelo Centro Universitário Fundação Santo André. Santo André.
PELCZAR JR, M.J; CHAN, E.C.S; KRIEG, N.R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2 ed. São Paulo: MAKRON Books, 1996. Volume I.