Bioquímica: proteínas, enzimas e carboidratos

Biologia

11/02/2015

As proteínas são moléculas essenciais para o desenvolvimento da vida. Elas fazem parte de diversas estruturas vitais para os organismos. Suas funções também são bastante variadas, atuando desde a proteção do organismo através dos anticorpos até catalisar reações químicas. Contudo, muitas vezes as concentrações dessas moléculas são desconhecidas.


Determiná-las é importante para evitar desequilíbrios no meio intra e extracelular. O cálculo dessa concentração pode ser feito por meio da Absorbância, que é capacidade de uma solução de absorver certa quantidade de energia do feixe de luz incidente. Esse processo ocorre mediante a absorção de energia radiante monocromática de um composto químico em solução em um equipamento especial (espectrofotômetro). A intensidade de absorção depende do comprimento de onda escolhido, do percurso feito pelo feixe de luz e da concentração do composto na solução.


O método do Biureto é um dos métodos utilizados para calcular a concentração desconhecida de soluções através da Absorbância. Por esse método, íons Cobre2+ (Cu) formam ligações com o nitrogênio das ligações peptídicas, em meio alcalino. Esse complexo formado pelo Cu2+ com quatro aminoácidos permite a leitura do aparelho.


Desta reação (reação de Biureto) resulta uma coloração púrpura intensa, que absorve fortemente a radiação a 540nm. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de proteína de uma solução. A cor desenvolvida numa reação de íons de Cu2+em meio alcalino com estas proteínas deve-se exclusivamente às ligações peptídicas e a sua intensidade é proporcional a quantidade de tais ligações.


Determinar as concentrações de algumas moléculas é essencial para conhecer os mecanismos de regulagem metabólica e a capacidade das moléculas sofrerem alterações, formando produtos, liberando ou absorvendo energia.


O desenvolvimento de todos os organismos, desde microscópicas bactérias até os maiores mamíferos envolve uma série de reações químicas entre moléculas orgânicas e inorgânicas. Essas reações podem ser espontâneas, liberando energia para o meio. São chamadas de reações exergônicas. Nesse tipo de reação o produto formado tem menos energia do que o(s) reagente(s) envolvido(s). Entretanto, existem reações que não são espontâneas e, portanto, consomem energia do meio em que se encontram. Além disso, seus reagentes possuem menos energia do que os produtos. Essas reações precisam de reações acopladas (exergônicas) para ocorrer. São chamadas de reações endergônicas. Esses dois tipos de reações compõem as vias metabólicas de síntese (anabolismo) e de degradação (catabolismo) de moléculas, tornando-as assimiláveis às células.


Para calcular o valor numérico da energia produzida ou absorvida, é usada uma constante chamada de Energia livre de Gibbs (?G), que é a variação padrão de energia livre e se relaciona com a constante de equilíbrio (Keq) da reação. No entanto, o ?G padrão (?G°’) ocorre apenas nas seguintes condições: concentração de 1Molar (mol/L), temperatura 25°C, 1 atm e potencial hidrogeniônico igual a 7 (neutro). Essas condições determinam o equilíbrio, portanto, a energia livre de Gibbs é igual a zero e as concentrações de reagentes e produtos são iguais.


Contudo, em sistemas biológicos, nem sempre as concentrações são de 1 Molar e o Keq é igual a 1, alterando o valor do ?G°’ que recebe o símbolo de ?G’. Quando a concentração de produto é maior do que a de reagentes, a constante possui um valor maior que 1, seu ?G°’ é negativo e a formação de produtos é favorecida. Mas quando a concentração de a reagentes é maior, o Keq possui valor menor que 1, o ?G°’ é positivo e a formação de reagentes é favorecida. Quando essas condições variam é possível calcular o ?G’ até atingir o equilíbrio, a partir da equação ?G’=?G°’ + 2,3RT.logKeq, onde R é a constante universal dos gases (8,3 J/mol,K) e T é a temperatura em Kelvin (K).

Nos sistemas biológicos, as reações são endergônicas, portanto, não são espontâneas. Às vezes é possível inverter o sentido de uma reação biológica apenas pelo ajuste das concentrações. No entanto, nem sempre é possível reverter a direção de uma reação com mudanças nas concentrações iniciais de produtos e reagentes. Isso ocorre, pois muitas reações formam produtos que servirão de reagentes para outras reações. Essas reações estão acopladas e o ?G°’total é dado pela soma dos ?G°s e a Keqtotal é dado pela multiplicação do Keq de cada reação.


Além disso, muitas dessas reações ocorrem lentamente, desfavorecendo os processos vitais. Existem duas maneiras de conseguir a energia necessária para acelerar essas reações. A primeira é a partir do aumento de temperatura, aumentando a vibração entre os reagentes e formando produtos. A segunda foi feita pela natureza, que criou moléculas evoluídas capazes de acelerar reações. Essas moléculas especiais, chamadas enzimas, diminuem o valor da Energia de Ativação (EA - energia necessária para ativar uma reação e atingir um estado intermediário entre os reagentes e os produtos).


As enzimas são catalisadores biológicos, geralmente de natureza proteica, que aumentam a velocidade de uma reação, diminuindo o valor de EA, sem serem consumidas. Essas moléculas são altamente específicas, e ligam-se as outras moléculas, os substratos, que interagem com o sítio ativo enzimático por interações covalentes entre os grupos R, e que promove a atividade enzimática, facilitando a formação do estado de transição (complexo enzima-substrato), sem alterar o equilíbrio químico da reação que participa e posteriormente, a formação do produto e a liberação da enzima. As enzimas são altamente específicas, reagindo com apenas um tipo de substrato, No entanto, as enzimas também são degradas. Elas possuem um determinado tempo (meia vida) em que ficam no citoplasma e catalisam reações.


Existem vários tipos de enzimas. As oxidases, transferases, hidrolases, isomerases, ligase e liases. Além disso, essas moléculas catalisadoras podem ligar-se a estruturas adicionais, chamadas de co-fator, que podem ser íons metálicos (metaloenzimas) ou moléculas orgânicas (coenzimas). Existem enzimas que estão em seu estado inativo, mas que se tornam ativas ao sofrerem clivagem, como o tripsinogênio (inativo) e a tripsina (ativa). São chamadas de zimôgenos e são principalmente as enzimas digestivas. Esse estado inativo é importante para evitar que as reações ocorram sem parar e prejudiquem o funcionamento do organismo.


A cinética enzimática ocorre quando o substrato se liga ao sítio ativo de uma determinada enzima. No entanto, as condições do meio são essenciais para que essas reações ocorram. O pH, a temperatura, a concentração de sais são extremamente importantes para que a catálise ocorra. No entanto, é preciso tomar cuidado com alterações no pH e na temperatura do meio, pois esses fatores podem levar a desnaturação das enzimas, que perdem sua conformação e consequentemente, sua função. O pH também influencia nos estados protonado e desprotonado da enzima, alterando a eficiência da reação.


Além desses fatores, a concentração dos reagentes e produtos influencia na atividade enzimática. Quanto maior a concentração de substrato, maior a velocidade da reação e maior o número de produtos formados. Enquanto há substrato, há formação de complexo enzima substrato, portanto, o aumento da velocidade ocorre em cinética de primeira ordem. A velocidade é proporcional à concentração do substrato. No entanto, em um determinado momento, a velocidade passa a ser constante e máxima, pois todo substrato já foi consumido. Esse momento é chamado de cinética de ordem zero. O ponto que indica essa velocidade máxima (Vmáx) também indica a concentração saturante. Quando essa concentração é atingida, o aumento do substrato não altera a Vmáx, pois toda enzima já está ligada com o substrato.
Para calcular a afinidade da enzima pelo seu substrato, é usada a constante de Michaelis-Menten (Km), que é numericamente igual a metade da velocidade máxima e indica a concentração de substrato quando a metade da Vmáx é atingida. Quando o Km é baixo, a afinidade da enzima por seu substrato é alta, portanto a concentração necessária para atingir a velocidade máxima e saturar a enzima é baixa. Entretanto, Km elevados mostram pouca afinidade da enzima com seu substrato, pois uma maior concentração de substrato é necessária para saturar a enzima. Outra constante (Kcat) determina o número de produtos gerados por uma enzima em 1 segundo. Quanto maior esse número, maior a eficiência catalítica de uma enzima.


Existem mecanismos de controle da atividade enzimática, que controlam a disponibilidade da enzima e de seus sítios ativos. Algumas moléculas podem impedir a ligação do substrato ao sítio ativo. Essa inibição pode ser irreversível, ou reversível. A inibição reversível pode ser competitiva, em que o inibidor se liga ao mesmo sitio ativo que o substrato, e eleva o Km. Já o inibidor não competitivo liga-se a um sítio diferente, modificando o sítio ativo. Quando ele se desliga, o sítio ativo retoma sua conformação original. Nesse processo, a velocidade máxima da reação diminui, mas não interfere no valor do Km.


Contudo, a atividade enzimática pode ser interrompida por outras moléculas, que podem participar do controle da atividade enzimática ou serem resultados de reações indesejadas como no caso de algumas doenças por inativação. As enzimas podem ser inibidas de diversas maneiras, reversível ou irreversivelmente. Na inibição irreversível, o inibidor liga-se fortemente ao sítio ativo da enzima. Existem dois tipos de inibição reversível, a competitiva, em que o inibidor e o substrato competem pelo mesmo sitio ativo enzimático e provoca um aumento do Km, pois precisa-se de uma maior concentração de substrato para superar a do inibidor; e a não competitiva, em que o inibidor liga-se a um sitio diferente, modificando o sitio ativo cujo o substrato se liga. Quando esse inibidor desliga-se da enzima, o sitio ativo retoma sua forma original. Esse tipo de inibição não influencia na constante de Michaelis-Menten. Outros tipos de inibição, como a alostéria, retroalimentação ou inibição por produto final e modificações covalentes como a fosforilação e defosforilação também participam do controle enzimático.


A invertase é uma enzima da classe das hidrolases, que quebra moléculas pela adição de água. Essa enzima catalisa a hidrólise da sacarose, um carboidrato dissacarídeo formado por glicose e frutose. Essa enzima, ao hidrolisar a sacarose, provoca uma inversão no sinal da rotação óptica de positivo para negativo, sendo denominado de açúcar invertido.


A sacarose faz parte dez um grupo de moléculas muito importante para o organismo, como as proteínas. Esse grupo é chamado de carboidratos, hidratos de carbono ou glicídios. Popularmente são chamados de açúcares, mas nem sempre possuem sabor adocicado. Essas moléculas são compostas por Carbono, Hidrogênio e Oxigênio, pela fórmula (CH2O)n, mas também podem apresentar átomos de nitrogênio (N), enxofre (S) e fósforo (P). A principal função dessas moléculas é reserva energética de célula animal e vegetal, sendo estes glicogênio e amido, respectivamente. Essas moléculas também são intermediários metabólitos e participam da estrutura dos ácidos nucléicos (RNA e DNA) e do glicocálice das membranas plasmáticas e da parede celular de bactérias e vegetais. Combinados com proteínas, os polissacarídeos estruturais que compõem a matriz extracelular, formam glicosaminoglicanas, proteoglicanas e glicoproteínas, essenciais no reconhecimento celular.


Os carboidratos são divididos em dois grupos, aldoses e cetoses. As aldoses possuem como grupo funcional um aldeído (CH=O) e as cetoses possuem como grupo funcional uma cetona (C=O). Eles também são classificados como monossacarídeos (glicose, frutose, lactose), dissacarídeos (sacarose, maltose, galactose) e polissacarídeos. Os principais polissacarídeos são a celulose, o amido e o glicogênio. Essas moléculas são unidas por ligações glicosídicas, que ocorrem nos grupos hidroxilas (-OH) dos carboidratos.


A caracterização dos carboidratos é feita por reações de coloração. Os reativos usados para colorir esses carboidratos são compostos por ácidos fortes, como ácido sulfúrico (H2SO4) e ácido clorídrico (HCl) e um grupo fenol, que desidratam os carboidratos, originando aldeídos cíclicos, que podem combinar com fenóis e formar compostos corados. Os reativos usados são o Reativo de Molisch, o Reativo de Bial, e o Reativo de Selowanoff.