Bioquímica: Tampão e Proteínas

Biologia

11/02/2015

A Bioquímica é o ramo das ciências naturais que estuda a química da vida e revela a existência de inúmeras substâncias diferentes em uma única célula como a cadeia de reações químicas das quais elas participam. Com isso, cientistas foram capazes de usar os princípios da química para descobrir os principais elementos dos seres vivos. Ao analisá-los, eles encontraram principalmente carbono (C), hidrogênio (H), oxigênio (O), nitrogênio (N), fósforo (P) e enxofre (S). A ligação entre esses átomos permite a existência de uma enorme variedade de moléculas orgânicas, fundamentais para os organismos vivos.


Esses átomos essenciais compõem as principais moléculas orgânicas dos seres vivos, as proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e carboidratos. Entretanto a maior parte da composição dos organismos é de água. Uma molécula assimétrica de hidrogênio e oxigênio ligada por interações covalentes polares. Essa ligação covalente da água, chamada ponte de hidrogênio, é muito importante na ligação entre cadeias proteicas e outras moléculas de um organismo.


Além disso, a água é o melhor solvente para a maioria das substancias químicas, com exceção dos lipídios, pois ela possui maior tendência a se combinar com íons positivos e negativos, do que eles combinarem entre si. Moléculas capazes de se dissolverem em água são polares e, portanto, hidrofílicas. Já as substâncias apolares, que não se dissolvem em água, são hidrofóbicas. No entanto, em uma mesma molécula podem existir regiões hidrofílicas e hidrofóbicas, como os fosfolipídios que compõem a membrana plasmática das células, sendo assim chamadas de moléculas anfipáticas.


1.1 Tampões e pH
Além das moléculas orgânicas, os seres vivos necessitam de substâncias inorgânicas para manter seu equilíbrio vital. Essas são os sais minerais. Os sais minerais são necessários para o bom funcionamento do organismo dos seres vivos. Íons como magnésio, zinco, cálcio e potássio participam de reações químicas vitais às células. Outros sais inorgânicos são essenciais para o controle da concentração de íons hidrogênio (H+) nas matrizes extras e intracelulares. Essa concentração é chamada de potencial hidrogeniônico, pH, e determina a acidez do meio, ou seja, quanto maior a concentração de H+, mais ácido o meio e menor o pH. As reações químicas só ocorrem em determinada faixa de pH, portanto, mantê-lo constante ou com a menor variação possível é necessário para manter o funcionamento do organismo sem grandes desequilíbrios.


Ácidos e bases são substancias que alteram o pH de uma solução, contudo, sua definição vai além desse conceito. Para o químico Arrhenius, “Substâncias ácidas são aquelas que em solução aquosa dissociam-se em íons hidrogênios” e “Substâncias básicas são aquelas que em solução aquosa dissociam-se em íons hidroxilas”. No entanto, em certos casos, essa teoria não se aplicava bem em soluções que eram aquosas e até mesmo nestas condições onde certas substâncias com caráter ácido ou básico não forneciam íons H+ ou OH -, respectivamente.


Porém, o conceito mais aceito é o de Brønsted-Lowry, em que “Ácido é definido como um doador de próton e base como um receptor de próton”, por levar em consideração que uma substância não pode atuar como ácido sem a presença de uma base para aceitar o próton, e vice-versa. Para expressar a quantidade de íons hidrogênios ou hidroxila liberados por um ácido ou base em uma solução, é usado um valor constante, conhecido como constante de dissociação de um ácido ou de uma base (Ka e Kb), que determina sua força. Ácidos e bases que se ionizam completamente em uma solução são considerados fortes, como HCl e NaOH; e os que possuem uma ionização parcial são considerados fracos, como o ácido acético e MgOH.

A água também possui uma constante de ionização, o Kw, que determina sua tendência de dissociar-se e formar os íons hidrogênio e hidróxido. Assim foi possível estabelecer um estado em que o pH esta neutro, ou seja, nem ácido, nem básico. Isso ocorre quando as concentrações de íons H+ e OH- são iguais. Para indicar o pH de uma solução são usados indicadores de ácido-base (corantes que alteram sua coloração de acordo com as concentrações relativas desses íons) ou através de um pHmetro.


Para relacionar pH, Ka e as concentrações de ácido e base conjugados é usada a equação de Herdenson-Hasselbalch, que demonstra a dissolução de um ácido fraco e que determina sua capacidade de manter um pH dentro de variações aceitáveis. Classificou-se assim uma solução tampão, ou seja, uma solução constituída de um ácido fraco e sua base conjugada que segura variações de pH quando adicionados ácidos ou bases. Além do pH e do Ka, há uma terceira constante, o pKa, que determina a força de um ácido pelo logaritmo negativo do Ka. Com a equação de Herdenson-Hasselbalch, observa-se o ponto isoelétrico, quando as concentrações de ácido e sua base conjugada são iguais, sendo 50% do ácido e 50% da base, o pH e o pKa possuem o mesmo valor. Assim, consegue-se maior eficiência dessa solução tampão, determinada por uma curva de titulação em gráfico pH x concentração de OH-.


A eficiência de uma solução tampão depende da concentração dessa solução, ou seja, quando maior a concentração, maior a capacidade tamponante; e a concentração relativa do ácido e da base conjugada. Soluções muito diluídas têm sua capacidade tamponante afetada. Ao adicionar um ácido forte em uma solução tampão, a base conjugada liga-se com os prótons doados pelo ácido forte, formando um ácido conjugado. A concentração de ácido aumenta e o pH diminui, porém menos do que diminuiria se não houvesse o ácido fraco. Portanto o ácido fraco segura drásticas variações do pH. Fenômeno similar ocorre quando uma base é adicionada, mas neste caso uma parte da base liga-se ao próton ocasionando a dissociação do ácido conjugado e o pH se tornaria levemente básico. Nas duas situações a constante de equilíbrio continuaria a mesma.


Em sistemas biológicos, a existência de soluções tamponantes é fundamental para manter o metabolismo em equilíbrio. Muitas moléculas são extremamente sensíveis às variações de pH, sofrendo mudanças significativas quando se está muito acima ou abaixo de seu pH ótimo. Fluidos como o sangue e o citoplasma têm um pH definido, geralmente em torno de 7,4, e permanece constante graças à presença de diversas substâncias tamponantes dissolvidas. Macromoléculas como as proteínas podem desnaturar, perdendo sua função quando os valores de pH alteram-se drasticamente, provocando um desequilíbrio ao metabolismo.



1.2 Aminoácidos e Proteínas

As proteínas são as macromoléculas mais importantes de qualquer organismo vivo, sintetizadas no citosol da célula pela tradução de RNA e que desempenham funções estrutural, hormonal, catalisadora, nutricional, regulação do metabolismo e controle das funções gênicas e movimento. Os aminoácidos, que compõem as proteínas são constituídos de um carbono alfa, um hidrogênio um grupo R, que diferencia cada aminoácido e determina suas características, e os grupos carboxila (COOH) e amina (NH2) onde ocorre a ligação entre dois aminoácidos, chamada de ligação peptídica, que inicia formação das cadeias polipeptídicas das proteínas e libera uma molécula de água.


A partir do grupo R é possível determinar a polaridade e solubilidade dos aminoácidos, sendo os polares hidrofílicos e os apolares hidrofóbicos. Além disso, os grupos R determinam os tipos de interações que podem ocorrer entre esses grupos, como pontes de hidrogênio, interações iônicas, hidrofóbicas e pontes dissulfetos S-S (exclusivo em proteínas que possuem o aminoácido Cisteína, que apresenta grupo R com sulfidrila).


A existência de um carbono quiral permite a existência de duas formas de aminoácidos, os D-aminoácidos, encontrados apenas em antibióticos e na parede celular de bactérias e vegetais; e os L-aminoácidos, presentes nas proteínas da maioria dos organismos.


A estrutura de uma proteína revela quatro níveis estruturais. A estrutura primária é a seqüência de aminoácidos. As interações entre os grupos R dos aminoácidos da estrutura primária, levam a formação da estrutura secundária, que pode ser alfa-hélice ou folha-beta. Com o dobramento dos domínios (unidades funcionais fundamentais) forma a estrutura terciaria, originando proteínas fibrosas e globulares. A estrutura quaternária ocorre pela união de duas ou mais cadeias polipeptídicas idênticas ou diferentes estruturalmente e que podem desempenhar funções independentes ou trabalhar cooperativamente.
A perda da estrutura de uma proteína, ou seja, sua conformação nativa, ocorre devido sua sensibilidade as alterações químicas ou físicas no meio, como pH, temperatura, concentração de sais, metais pesados e substancias que desfazem possíveis pontes de hidrogênio (ureia) ou as pontes dissulfeto. Esse processo provoca a desnaturação de uma proteína e consequentemente, a perda de sua função. Tais processos, entretanto, podem ser irreversíveis, tornando algumas proteínas insolúveis - caso, por exemplo, da albumina.


Para conhecer determinadas propriedades dos aminoácidos, a maneira mais fácil de separá-los é a partir da cromatografia em papel ascendente. E este método físico-químico consiste na separação dos componentes de uma mistura, tendo por base a distribuição destes em duas fases, uma estacionária e outra móvel, que estão em contato. Os componentes menos solúveis da fase estacionaria movimentam-se mais rapidamente ao longo do papel e as mais solúveis movimentam-se mais lentamente. Além da cromatografia, há formas experimentais, através da mudança de cor das soluções, para se caracterizar aminoácidos. As mais conhecidas são a reação de Millon, a reação de Hopkins-Cole, a reação de Sakagushi e a reação de ninidrina.


A caracterização das proteínas ocorre a partir de algumas propriedades como massa molar, carga elétrica, a solubilidade ou por coloração e precipitação, provocada pela mistura com sais neutros, em que há a solubilização por salificação (salting in) ou a precipitação por salificação (salting out). A precipitação pode ser provocada também por sais de metais pesados ou por ácidos fortes e relacionam o pH e o PI dos compostos formados a partir da adição de alguma substância à amostra de proteína, no caso, soluções que contenham íons positivos de metais (Hg++; Pb++; Fe++, entre outros) e soluções de ácidos fortes.