Novos Kits de Diagnósticos

Biologia

10/09/2012

Muitos produtos de interesse comercial e de saúde pública já são obtidos atualmente por meio de técnicas biotecnológicas. Exemplos como a insulina humana, o hormônio de crescimento bovino, suíno e eqüino e substâncias beta-agonistas, foram obtidos com sucesso. Freqüentemente, a tecnologia envolvida em sua geração é a expressão em sistemas procariotos e eucariotos. Contudo, o mesmo objetivo pode ser alcançado utilizando animais transgênicos como biofábricas.
       
O método de diagnóstico mais utilizado na clínica médica e veterinária é o microbiológico. Contudo, o isolamento e a caracterização dos diversos microorganismos possuem limitações, principalmente no caso de linhagens em que o cultivo in vitro não é tão eficiente. A necessidade de meios de cultura específicos para cada patógeno, o tempo de crescimento in vitro, que pode variar de semanas a meses, e a presença de contaminantes são fatores limitantes quanto à utilização do método em questão. Portanto, há a necessidade de métodos diagnósticos capazes de obter um resultado de alta sensibilidade e especificidade em menor tempo, sendo o diagnóstico molecular uma alternativa promissora.

O diagnóstico molecular utiliza como base a identificação de seqüências de DNA específicas e características de cada patógeno. A técnica de eleição para este fim é a reação em cadeia da amplificação de ácidos nucléicos (PCR). Vários grupos de pesquisa desenvolvem este tipo de teste, comparando a sua vantagem frente a métodos de diagnóstico tradicionais. Dentro deste contexto, um trabalho comparou a sensibilidade entre a microscopia óptica, a imunofluorescência indireta e o PCR para a detecção de Brucella equi em eqüinos cronicamente infectados.
       
O ensaio mostrou que 38,8%, 50% e 78% dos animais formam positivos utilizando as técnicas anteriormente citadas, respectivamente. Ainda foi relatado o fato de o PCR ter detectado o agente etiológico até mesmo em baixos níveis de parasitemia. Estes resultados demonstram que o PCR é uma técnica bastante eficiente quanto ao diagnóstico de doenças infecciosas.
               
As provas de diagnóstico molecular são amplamente trabalhadas, o que se deve a sua alta sensibilidade e especificidade. O PCR é uma técnica capaz de amplificar uma seqüência de interesse a partir de picogramas do DNA da amostra, o que caracteriza sua alta sensibilidade. A alta especificidade das técnicas moleculares está relacionada com a amplificação de somente uma seqüência de DNA específica de cada patógeno, evitando respostas cruzadas com outros agentes que possuam características similares. Isto constitui uma vantagem em relação ao diagnóstico por testes sorológicos, uma vez que o mesmo pode identificar características compartilhadas por outros agentes etiológicos.
       
A escolha por um método de diagnóstico molecular baseado no PCR deve ser analisada com cautela. Apesar da alta sensibilidade e especificidade, os testes moleculares também apresentam limitações e problemas freqüentes. A reação pode gerar desde um falso-positivo, devido à presença de contaminantes, ou mesmo um falso negativo, pela presença de inibidores da reação na amostra clínica. 
       
Além destes problemas, outra questão se refere à falta de controles internos na reação, dificultando diferenciar entre um diagnóstico negativo verdadeiro e uma falha da técnica. Portanto, o aprimoramento da técnica e dos métodos de análise padrão constitue passos fundamentais para a implantação do diagnóstico molecular.

Uma opção ao diagnóstico por PCR é a utilização de uma de suas variantes, o PCR multiplex. Esta técnica se baseia na inclusão, em uma mesma reação de PCR, de pares de iniciadores capazes de amplificar diferentes seqüências de um determinado agente etiológico, incluindo uma que será amplificada com certeza em qualquer amostra clínica. Este tipo de controle interno diferenciará se o resultado é realmente negativo ou se decorre de um problema que tenha inibido a reação.
       
O PCR multiplex, apesar de ser uma variante com vantagens consideráveis sobre o PCR convencional, também possui suas limitações. Dependendo dos agentes que se queiram identificar, o número de pares de iniciadores a serem adicionados em uma mesma reação também é um fator limitante para uma amplificação adequada. Quando muitos são adicionados, observa-se uma diminuição, até mesmo expressiva, da sensibilidade do teste. Mesmo sendo possível a manipulação em alguns casos, a solução para este problema pode exigir o uso de outra técnica, como a hibridização reversa.

A hibridização reversa consiste de uma reação de PCR que utiliza um primer universal capaz de amplificar seqüências conservadas entre os agentes etiológicos a serem diagnosticados. Apesar de a região de anelamento dos iniciadores ser conservada, a porção interna da mesma deve conter seqüências variáveis e singulares a cada patógeno. A diferenciação entre eles é feita com o auxílio da hibridização. Para isso, utiliza-se um aparato especial que permite que várias amostras de PCR sejam analisadas ao mesmo tempo, em relação a diferentes agentes. Além disso, essa técnica é a de eleição em casos em que o objetivo seja o de diagnosticar infecções múltiplas, sendo ainda uma técnica de maior sensibilidade que o PCR.
       
Diante do exposto, a escolha do teste de diagnóstico a ser utilizado depende dos objetivos do pesquisador e das condições limitantes. Para diferentes situações são exigidas adaptações distintas. Por isso, novas técnicas estão sendo desenvolvidas, como:
       
O PCR em tempo real, que permite a quantificação do material referente aos possíveis alvos. Sua vantagem está na possibilidade de diferenciar entre a presença de uma seqüência de DNA e a sua expressão ativa;
       
A tecnologia do microarray, o qual pode ser utilizado na identificação de espécies, sorotipos, marcadores de virulência e resistência a antibióticos;
       
O seqüenciamento de genes derivados dos microorganismos.
       
A biotecnologia tem múltiplas aplicações em diversas áreas do conhecimento. Além da área da saúde, como o desenvolvimento da medicina terapêutica e preventiva, as técnicas derivadas da engenharia genética podem trazer benefícios para a agropecuária. Exemplos são a seleção assistida por testes de DNA e a clonagem.
       
       

A tecnologia do DNA recombinante permite ainda fornecer instrumentos para o melhoramento animal. A produção agropecuária exerce um importante patamar na economia e comércio internacional brasileiro. Assim, a pesquisa busca métodos eficientes para aperfeiçoar o potencial genético dos animais, resultando em uma produção mais rentável, com elevada produtividade e/ou agregação ao valor do produto.

Uma alternativa utilizada no melhoramento de animais utiliza a genética clássica de Mendel. Durante séculos este modelo tem sido empregado com sucesso para a seleção artificial de características benéficas. Contudo, esta metodologia apresenta desvantagens relevantes. Vários cruzamentos são necessários, tendo ainda que levar em consideração o tempo de amadurecimento sexual e do intervalo entre partos dos animais. Estas afirmações demonstram que se leva muito tempo até alcançar a característica desejada. 

Além disso, os resultados obtidos podem ser insatisfatórios, pois pode ocorrer de que outros genes ligados ao de interesse, que codificam características indesejadas, sejam repassados também. Diante destes fatos, percebe-se a necessidade de implantar estratégias que permitam trabalhar o melhoramento genético em um menor tempo de gerações para o surgimento da característica desejada. Uma destas estratégias é por meio das técnicas derivadas da biotecnologia molecular.

O melhoramento genético tem sido beneficiado de estudos com a genômica. Esta ciência envolve uma verdadeira anatomia molecular, como o mapeamento de cromossomos, iniciativas de estudos de transcriptomas em tecidos e órgãos, ou mesmo em fases da evolução embrionária. Contudo, estas informações são muito amplas e ainda restritas sobre a sua funcionalidade, dificultando a sua aplicação no melhoramento de animais. Um dos métodos mais promissores para a produção animal é o estudo de polimorfismos genéticos.

Os polimorfismos genéticos são variações nos alelos de um gene, o que resulta em diferentes genótipos. Esses marcadores moleculares podem estar ligados às características de interesse, como a taxa de ovulação, de crescimento e de composição corporal, da qualidade e função do sistema imunológico e, até mesmo, com a eficiência reprodutiva. Nestes casos, eles são pontos de partida para avaliar e escolher genótipos que devam ser propagados até alcançar a característica de interesse.

Os polimorfismos se aplicam, inicialmente, em estudos populacionais. As variações em alelos podem ser documentadas em estudos genealógicos, permitindo a montagem da estrutura da população. As vantagens da genômica para a análise de pedigrees na genética quantitativa se traduzem em uma maior acurácia, tendo-se que inferir menos a respeito das observações feitas a partir da prole obtida.

Estudos de pedigrees foram realizados na identificação de características de interesse e, conseqüentemente, para a seleção animal. Um exemplo foi o estudo sobre a deficiência do fator XI em gado, patologia que pode ser assintomática. Contudo, esta anomalia é pleiotrópica, afetando outras características de interesse econômico, como a reprodução e o estado imunológico dos animais. Sugere-se que o gado deficiente no fator XI, incluindo tanto os homozigotos quanto os heterozigotos, dá menor número de bezerros, além de serem mais susceptíveis às doenças infecciosas.

Diante do impacto econômico que a deficiência do fator XI tem sobre a produção animal, foram realizados estudos sobre a sua transmissão. Para isso, utilizou-se a análise de pedigree, que mostrou tratar-se de uma deficiência autossômica recessiva. Diante deste fato, um trabalho de genotipagem de gado foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a freqüência da mutação gênica na população.

A deficiência se deve a inserção que acrescenta aproximadamente 76b de uma espécie de cauda poliA. A diferenciação entre homozigotos e heterozigotos pode ser feita após a amplificação das seqüências alélicas pó PCR, sendo que o resultado pode ser visualizado após a eletroforese dos amplicons. Os animais homozigotos apresentam uma única banda, sendo que a de maior peso molecular indica que os animais são homozigotos recessivos. Diferentemente, os indivíduos heterozigotos são distinguidos dos demais pela visualização de duas bandas distintas no gel após a eletroforese da amostra.

Testes de genotipagem já vêm sendo realizados nos programas de melhoramento genético e nas centrais de inseminação artificial, permitindo o descarte de características indesejadas e as de baixa herdabilidade. Um exemplo é o teste para a susceptibilidade à síndrome do estresse suíno, o qual já se encontra disponível comercialmente. Outros testes disponíveis incluem os que permitem a análise de crescimento, reprodução e outros que afetam a qualidade dos produtos animais. 

O estudo de pedigree vem sendo também utilizado na reprodução animal para a seleção de reprodutores. A análise preliminar de alguns grupos ancestrais visa utilizar, de maneira mais racional, a variabilidade genética existente nos plantéis, ordenando quais seriam os melhores pares para o acasalamento. Esse tipo de análise vem sendo feito na Amazônia para a seleção de avestruzes. O mesmo estudo de polimorfismo é utilizado para este fim. 

O potencial da biotecnologia para a reprodução também tem sido aplicado em processos de sexagem de espermatozóides e de embriões. Estas técnicas são de grande interesse, principalmente para gado de leite, podendo selecionar somente os espermatozóides ou embriões que dêem origem a fêmeas. Isto evitaria o descarte de bezerros machos.

Outra tecnologia que foi testada ainda dentro do tema reprodução é a clonagem de animais. O primeiro animal clonado foi a ovelha Dolly, sendo que no Brasil foi a bezerra Vitória. Um dos ideais da clonagem consiste em aumentar a produção animal. Contudo, o custo envolvido com esta tecnologia a torna inacessível para esta finalidade. Outros aspectos são: a falta de conhecimento a respeito do funcionamento do genoma, além das questões éticas. Por isso, centros de pesquisas que trabalham na área estão investigando o comportamento fisiológico dos clones, para averiguar a viabilidade do processo.

O melhoramento genético de animais, com a introdução de uma característica de interesse em menor tempo, tem um grande interesse comercial. Além de inferir com mais acurácia os animais a serem cruzados, a biotecnologia ainda vem testando uma maneira mais rápida para obter a qualidade almejada, como o uso de animais transgênicos. Além desta aplicação, estes animais geneticamente modificados apresentam ainda outras aplicações extremamente interessantes.