Mecanismos de Replicação do DNA

Biologia

10/09/2012

No período de 1950, o cientista Arthur Kornberg identificou e purificou uma das enzimas envolvidas na replicação do DNA, a DNA polimerase I. Esta enzima tem três atividades:

Atividade de polimerase, catalisando o crescimento da cadeia na direção 5´- 3´;

Atividade exonucleásica 3´- 5´, removendo o pareamento de bases incorretas; Atividade exonucleásica 5´ - 3´, que degrada o DNA dupla fita.

Outras duas DNAP foram descobertas posteriormente. Postula-se que a DNAP II esteja envolvida no reparo de DNA; contudo, ainda não há uma função específica atribuída a esta enzima. A DNAP III atua na replicação do DNA, juntamente com a DNAP I. A DNAP III completa a replicação do DNA fita simples, isto é, se já existir um pequeno fragmento de DNA dupla fita. Este oligonucleotídeo é conhecido como “primer”.

O ponto específico da seqüência de DNA no qual a replicação se inicia é denominado origem de replicação. Em Escherichia coli, há uma origem de replicação. Uma vez iniciada, a replicação prossegue de forma bidirecional. Para que se inicie o processo, há a ligação da proteína DNA A e, em seguida, há a desnaturação do DNA.
       
Em eucariotos, a replicação é mais complexa. Experimentos com moléculas de DNA marcadas demonstraram a existência de inúmeras regiões de replicação dentro de um único braço cromossomal. Estima-se que haja cerca de 400 origens de replicação distribuídas entre os 17 cromossomos de levedura e 10.000 para humanos. Além disso, a replicação em eucariotos é um processo altamente coordenado dentro de um mesmo cromossomo e em todo o conjunto celular destas estruturas.

Em presença de nucleotídeos trifosfatos, a DNAP polimeriza uma nova molécula de DNA dupla fita. Contudo, este procedimento de extensão da fita é dependente da prévia existência de um pequeno oligonucleotídeo de aproximadamente 30 pb. Este “primer” pode ser sintetizado tanto por uma RNA polimerase (RNAP) como pela enzima denominada primase. Portanto, somente após a síntese do “primer” complementar a uma determinada seqüência de DNA, haverá a extensão da cadeia pela DNAP.

A síntese de novas cadeias pela DNAP ocorre na direção 5´- 3´. Pela natureza antiparalela da fita de DNA, a enzima se move sobre a fita molde na direção 3´ - 5´. A síntese de uma nova fita, designada “leading” é contínua. Por outro lado, a desnaturação do DNA também expõe outra fita molde que corre no sentido 5´- 3´, a “lagging”. Então, a forquilha de replicação – ponto em que as duas fitas de DNA se separam para permitir a replicação de cada fita – tem de seguir no sentido contrário da outra fita para que a polimerização seja de 5´- 3´.

Para que a replicação ocorra ao mesmo tempo nas duas fitas, a polimerização na “lagging” é realizada em pequenos segmentos descontínuos. Inicialmente, um “primer” de RNA é sintetizado de forma complementar ao DNA. Em seguida, ocorre então a polimerização e elongação da fita de DNA pela DNAP. Estes fragmentos de DNA foram identificados pela primeira vez por Reiji Okazaki e, por isso, são denominados fragmentos de Okazaki. A atividade exonucleásica no sentido 5´- 3´da DNAP I remove os “primers” de RNA e preenche esta seqüência com um segmento fita simples de DNA. Estes são então selados pela enzima DNA ligase, que catalisa a ligação do fosfato 5´ a um grupo 3´ OH adjacente. Esta ligação ocorre assim que a forquilha expõe a fita “lagging” e prossegue até que o fragmento precedente seja alcançado.

A fita “lagging” sofre uma volta sobre o complexo enzimático responsável pela replicação do DNA. Esta volta permite que a RNAP III sintetize ambas as fitas filhas. Depois de percorridos aproximadamente 1.000 pb, o fragmento dupla fita de DNA da fita “lagging” é liberado pela DNAP III, permitindo que uma nova volta seja formada sobre a molécula de DNA.
       
Este modelo possibilita que a holoenzima de DNAP III sintetize ambos os filamentos filhos.

A replicação do DNA envolve um complexo enzimático. Além da DNAP e da primase, há outras enzimas envolvidas, como as helicases. Estas são essenciais para o início da replicação do DNA, pois são as responsáveis por romper as pontes de hidrogênio que mantêm as duas fitas de DNA unidas. Esta fita simples é estabilizada pela ligação da proteína SSB, que se liga à fita simples de DNA e, com isso, retarda a formação do dúplex.
       
        Ambas as DNAP I e III possuem atividade exonucleásicas 3´ - 5´, o que permite verificar e editar bases inseridas erroneamente ou mal pareadas. Esta atividade é fundamental para a manutenção da fidelidade da informação genética. Mutantes deficientes nesta atividade apresentam maior taxa de mutação.

Muitos questionamentos foram feitos após a descoberta da estrutura e de outros processos que envolvem o DNA. Entre eles, o que realmente intrigava e fascinava os pesquisadores era a descoberta de como a informação genética presente em seqüências de DNA são transmitidas até a síntese de proteínas. O primeiro passo para atingir este objetivo foi entender o processo de transcrição.

Transcrição

Após a descoberta do DNA, os pesquisadores então queriam entender como a informação genética contida nesta seqüência de bases era traduzida em proteínas. A primeira especulação poderia ser que esta transferência era realizada diretamente do DNA em proteínas. Contudo, a união da genética e da citologia permitiu elucidar muitos fatos. A observação de que o material genético em células eucariotas se encontrava no núcleo e as proteínas no citoplasma demonstravam a necessidade de uma molécula intermediária. Posteriormente, o processo foi elucidado e o intermediário nesta transferência de informações é o RNA.

Estrutura do RNA

A estrutura básica do RNA é bem semelhante a do DNA. Ambos são formados por uma cadeia constituída pela união de nucleotídeos por meio de ligações fosfodiésteres. Apesar da semelhança, o RNA apresenta algumas diferenças estruturais se comparado ao DNA:

A primeira diferença está na composição dos nucleotídeos. No DNA, eles podem ser compostos por quatro bases distintas: adenina, citosina, guanina e timina. No RNA, três bases nitrogenadas são as mesmas daquelas encontradas no DNA: adenina, citosina e guanina. Contudo, ao invés da timina, a base denominada uracila compõe um dos tipos de nucleotídeos de RNA. Apesar desta diferença, a uracila forma pontes de hidrogênio com a adenina, assim como o faz a timina.

A segunda diferença ainda está relacionada com o tipo de açúcar que compõe o nucleotídeo. O açúcar que compõe o DNA é a desoxirribose e no RNA é a ribose. A única diferença entre estes açúcares é a presença ou a ausência de um átomo de oxigênio na posição do carbono 2. Por fim, o RNA é constituído por uma fita simples e não por uma fita dupla como o DNA. Conseqüentemente, o RNA não forma a estrutura de dupla hélice observada no DNA. Pelo contrário, a fita simples permite que haja diversas combinações no pareamento de bases. Assim, a estrutura tridimensional do RNA pode formar diferentes complexos, que são apresentados sob variados aspectos. Esta característica é importante sobre o ponto de vista tecnológico, pois a fita simples interfere negativamente com muitos processos de interesse biotecnológico. Um exemplo é a dificuldade em produzir em larga escala proteínas de interesse farmacêutico quando o RNA assume uma conformação inadequada.

O conhecimento da estrutura dos ácidos nucléicos foi o primeiro passo para as pesquisas subseqüentes. Apesar do DNA e RNA apresentarem algumas diferenças em sua estrutura, o que se observa é a grande semelhança quanto a sua constituição. A partir disso, foi sugerido pelos cientistas que o RNA pudesse ser então a molécula intermediária na transferência da informação genética contida no DNA em proteínas. Então, estudos foram dirigidos neste sentido para elucidar o papel do RNA na expressão de proteínas.

Para verificar se o RNA poderia funcionar como mensageiros elegantes estudos genéticos foram realizados. Inicialmente, precursores de RNA marcados radioativamente foram capturados por células em cultura. A localização deste material a ser utilizado na síntese de moléculas de RNA foi então observada durante um curto intervalo de tempo por auto-radiografia. Após receberem precursores marcados, em um primeiro momento este material se encontrava no núcleo. Após certo tempo, o material também pôde ser visualizado no citoplasma. Portanto, aparentemente o RNA é sintetizado no núcleo e, em seguida, segue para o citoplasma.

O uso de precursores de RNA pré-marcados demonstrou que o RNA é sintetizado no núcleo e em seguida, segue para o citoplasma.

O experimento inicial com os precursores pré-marcados foi ainda reforçado com estudos realizados por Elliot Volkin e Lawrence Astrachan em 1957. O modelo experimental adotado por estes pesquisadores partiu de estudos de infecção da bactéria E. coli com o fago T2. Este fago é capaz de inserir seu material genético no cromossomo desta bactéria (profago) e utilizar a maquinaria da célula infectada para a produção de suas próprias proteínas. Os pesquisadores então compararam a seqüência do RNA sintetizado após a infecção da E. coli com o DNA do fago inserido no genoma da bactéria e descreveram a grande similaridade entre os dois. Assim, foi possível concluir que o RNA é sintetizado a partir do DNA e que, de alguma maneira, o mensageiro é utilizado na síntese protéica.

Vale ressaltar que os transcritos podem ter diferentes funções. Alguns RNA têm função estrutural. O RNA ribossômico (RNAr) é um dos constituintes dos ribossomos. O RNA transportador (RNAt) tem função de molécula carreadora, transportando os aminoácidos. O RNAm, por fim, é a molécula intermediária que serve como molde para a síntese protéica.

As semelhanças entre a estrutura do DNA e do RNA foram então os pontos que os pesquisadores tiveram como hipótese de que o RNA pudesse ser o mensageiro para a síntese protéica. Após obterem esta confirmação pelos experimentos com precursores marcados, o passo seguinte é entender o mecanismo da cópia fiel do DNA em RNA.